一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量測定試劑盒說明書
微量法 100 管/96 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：
NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。
測定原理：
在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO —，在酸性條件下，NO2—與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在 550nm 處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以計算 NO 含量。
組成：
產(chǎn)品名稱 | DC6004-100T/96S | Storage |
提取液：液體 | 100ml | 4℃ |
試劑一：液體 | 6ml | 4℃避光 |
試劑二：液體 | 6ml | 4℃避光 |
說明書 | 一份 |
試劑二：液體 6ml×1 瓶，4℃避光保存。(用之前 60℃加熱震蕩 15min)
自備儀器和用品：
天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。
樣品處理：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進行冰浴勻漿。10000g，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g， 4℃，離心 15min，取上清置于冰上待測。
3. 體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測定。
測定步驟和操作表：
1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 550nm。
2、操作表
| 空白管 | 測定管 |
樣品（μl） |
| 100 |
提取液（μl） | 100 |
|
試劑一（μl） | 50 | 50 |
試劑二（μl） | 50 | 50 |
混勻，室溫靜置 15min，于微量石英比色皿/96 孔板，測定A550，ΔA=A 測定-A 空白 |
NO 含量計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103，R2= 0. 9986 1、組織樣品：
（1） 按樣本質(zhì)量計算
NO 含量（μmol/g 鮮重）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）×10-3
= 0.125×（ΔA +0.0103）÷W
（2） 按樣本蛋白濃度計算
NO 含量（μmol/mg prot）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr）×10-3
= 0.125×（ΔA +0.0103）÷Cpr
2、細胞：
NO 含量（μmol/104 cell）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量）×10-3
= 0.125×（ΔA +0.0103）÷細胞數(shù)量（萬個）
3、其他樣品：
NO 含量（μmol/L）=（ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷V 樣
= 125×（ΔA +0.0103）
V 反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/ml
b. 用 96 孔板測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為：y= 0.008x - 0.0103，R2= 0. 9986 1、組織樣品：
（1） 按樣本重量計算
NO 含量（μmol/g 鮮重）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）×10-3
= 0.25×（ΔA +0.0103）÷W
（2） 按樣本蛋白濃度計算
NO 含量（μmol/mg prot）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣×Cpr）×10-3
= 0.25×（ΔA +0.0103）÷ Cpr
2、細胞：
NO 含量（μmol/104 cell）=（ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量）×10-3
= 0.25×（ΔA +0.0103）÷細胞數(shù)量（萬個）
3、其他樣品：
NO 含量（μmol/L）=（ΔA +0.0103）÷0.008× V 反總÷V 樣= 250×（ΔA +0.0103）
V 反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.1ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/ml
